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本发明公开了一种长余辉纳米探针组合在检测细菌生物被膜中的应用,属于分析检测领域。本发明长余辉纳米探针组合包含至少三种在不同发光颜色的稀土元素掺杂的硫氧化镧长余辉纳米材料上修饰不同电荷和亲疏水性的有机配体构成的探针,其中稀土元素掺杂的硫氧化镧长余辉纳米材料通过高温热分解法得到。本发明的探针组合可制备成检测试剂盒,并与机器学习相结合用于细菌生物被膜的鉴定。本发明不仅能实现不同种类细菌生物被膜的准确鉴定和不同亚种细菌生物被膜的准确鉴定,还能实现对生物医学植入物如心脏起搏器上的细菌生物被膜的检测。基于本发明探针组合检测细菌生物被膜,操作简单方便、灵敏度高、准确性好,有望用于细菌生物被膜感染的临床诊断。