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本发明属于纳米生物材料技术领域,具体为一种单发射上转换纳米荧光探针及其合成方法。本发明荧光探针是一种一核三壳层结构的纳米晶体,其包括上转换发光中心核层、惰性壳层、二氧化硅壳层和染料掺杂二氧化硅壳层四个部分;上转换发光中心为激活离子掺杂的稀土纳米晶体,惰性壳层完全包裹发光核心;二氧化硅壳层可以避免上转换发光中心和染料之间的荧光共振能量转移;染料掺杂二氧化硅壳层用于去除不需要的上转换发射峰,选择保留特定的上转换发射峰,实现单发射上转换荧光。本发明可以同时原位检测多个信号分子,进一步提高检测的灵敏度以及准确度。本发明的荧光探针在蛋白表达、生物样品高通量筛选、多通道生物学检测和疾病诊断等方面具有广阔的应用前景。