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本发明公开了一种利用荧光检测乳酸脱氢酶活性的纳米生物传感器,其特征在于,其是以水热法合成的具有红光发射的掺杂Mn2+的立方相稀土上转换发光纳米粒子为基础,通过其表面油酸配体与尼罗蓝衍生物(NB‑C18PMH‑PEG)之间的亲疏水相互作用制成的,具有水溶性,结构稳定,化学组成差异小,且传感信号强度较高的杂化纳米生物传感器。本发明还提供了其制备方法及应用。本发明提供的杂化纳米生物传感器稳定性好、生物相容性好,利用其上转换荧光成像信号,可在体外起到辅助癌细胞诊断以及药物筛选的作用,满足临床诊断与抗癌药物研发的需求。本发明提供的制备方法具有制备工艺简洁、高效、质量稳定的特点。