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本发明公开了一种上转换超分辨成像纳米探针及其制备方法和应用,上转换超分辨成像纳米探针具有核@壳结构,制备方法是先采用溶剂热法,制备得到粒径可控、分散性好的稀土上转换纳米颗粒,再经过聚丙烯酸表面修饰,最后进行蛋白质修饰。将上述的上转换超分辨成像纳米探针应用于细胞的亚细胞结构的免疫荧光标记,从而实现亚细胞结构的荧光超分辨成像。相比传统的基于荧光素的超分辨光学成像方法,本发明是一种基于上转换超分辨成像纳米探针的荧光零漂白、零闪烁超分辨显微成像方法,能够对生物样品长时间观察。