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本发明公开了一种荧光损耗方法、显微成像方法及显微成像装置。所述荧光损耗方法利用近红外损耗光在稀土掺杂上转换纳米材料的敏化离子中引起受激吸收,将近红外激发光的能量转移至能量传递离子,从而实现对上转换纳米材料的多光子荧光进行损耗。基于该荧光损耗方法,提出将近红外损耗光利用空间相位调制板调制为空心光束,与激发光束进行准直共轭聚焦后实现对稀土掺杂上转换纳米材料及其标记样品的显微成像。基于该显微成像方法,搭建由激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块和光电探测模块组成的超分辨光学显微成像系统,获得低成本、低复杂度、高分辨率、简便、有效的实时动态三维图像。